PCR reaktsiyalarida shovqin omillari

PCR reaktsiyasi paytida ba'zi bir aralashuvchi omillar tez-tez uchraydi.
PCR ning juda yuqori sezgirligi tufayli kontaminatsiya PCR natijalariga ta'sir qiluvchi eng muhim omillardan biri hisoblanadi va noto'g'ri ijobiy natijalar berishi mumkin.
Noto'g'ri-salbiy natijalarga olib keladigan turli manbalar bir xil darajada muhim. Agar PCR aralashmasining bir yoki bir nechta muhim qismlari yoki kuchaytirish reaktsiyasining o'zi inhibe qilinsa yoki aralashsa, diagnostika tahliliga to'sqinlik qilishi mumkin. Bu samaradorlikning pasayishiga va hatto noto'g'ri salbiy natijalarga olib kelishi mumkin.
Inhibisyonga qo'shimcha ravishda, namunani tayyorlashdan oldin jo'natish va/yoki saqlash sharoitlari tufayli maqsadli nuklein kislota yaxlitligi yo'qolishi mumkin. Xususan, yuqori harorat yoki noto'g'ri saqlash hujayralar va nuklein kislotalarning shikastlanishiga olib kelishi mumkin. Hujayra va to'qimalarning fiksatsiyasi va kerosin bilan biriktirilishi DNK parchalanishining yaxshi ma'lum sabablari va doimiy muammodir (1 va 2-rasmlarga qarang). Bunday hollarda, hatto optimal izolyatsiya va tozalash ham yordam bermaydi.

1-rasm | Immobilizatsiyaning DNK yaxlitligiga ta'siri
Agaroz gel elektroforezi shuni ko'rsatdiki, otopsiyalarning kerosin qismlaridan ajratilgan DNK sifati sezilarli darajada farq qiladi. Ekstraktlarda fiksatsiya usuliga qarab har xil o'rtacha uzunlikdagi DNK mavjud edi. DNK faqat mahalliy muzlatilgan namunalarda va buferlangan neytral formalinda o'rnatilganda saqlanib qoldi. Kuchli kislotali Bouin fiksatori yoki tamponlanmagan, chumoli kislotasi o'z ichiga olgan formalindan foydalanish DNKning sezilarli darajada yo'qolishiga olib keldi. Qolgan fraksiya juda parchalangan.
Chap tomonda fragmentlar uzunligi kilobaza juftlarida (kbp) ifodalangan.

2-rasm | Nuklein kislota maqsadlarining yaxlitligini yo'qotish
(a) Ikkala ipdagi 3'-5' bo'shliq maqsadli DNKning uzilishiga olib keladi. DNK sintezi hali ham kichik fragmentda sodir bo'ladi. Biroq, agar DNK fragmentida primer tavlanish joyi yo'q bo'lsa, faqat chiziqli kuchaytirish sodir bo'ladi. Eng qulay holatda, fragmentlar bir-birini qayta tiklashi mumkin, ammo hosildorlik kichik va aniqlash darajasidan past bo'ladi.
b) Asosan depurinatsiya va timidin dimer hosil bo’lishi natijasida asoslarning yo’qolishi H-bog’lar sonining kamayishiga va Tm ning kamayishiga olib keladi. Uzaygan isinish bosqichida primerlar DNK matritsasidan eriydi va unchalik qattiqroq sharoitlarda ham tavlanmaydi.
(c) qo'shni timin asoslari TT dimerini hosil qiladi.
Molekulyar diagnostikada tez-tez uchraydigan yana bir keng tarqalgan muammo - fenol-xloroform ekstraktsiyasi bilan solishtirganda maqsadli nuklein kislotalarning optimal darajada kamroq chiqarilishi. Haddan tashqari holatlarda bu noto'g'ri salbiy bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Qaynatilgan lizis yoki hujayra qoldiqlarini fermentativ hazm qilish orqali ko'p vaqtni tejash mumkin, ammo bu usul ko'pincha nuklein kislotaning etarli darajada chiqarilmasligi tufayli PCR sezgirligiga olib keladi.

Amplifikatsiya paytida polimeraza faolligini inhibe qilish

Umuman olganda, inhibisyon, suboptimal PCR natijalariga olib keladigan barcha omillarni tavsiflash uchun konteyner tushunchasi sifatida ishlatiladi. Qattiq biokimyoviy ma'noda, inhibisyon fermentning faolligi bilan chegaralanadi, ya'ni DNK polimerazasining faol joyi yoki uning kofaktori (masalan, Taq DNK polimeraza uchun Mg2+) bilan o'zaro ta'sir qilish orqali substrat-mahsulot konversiyasini kamaytiradi yoki oldini oladi.
Namunadagi komponentlar yoki turli xil tamponlar va reagentlarni o'z ichiga olgan ekstraktlar fermentni bevosita inhibe qilishi yoki uning kofaktorlarini (masalan, EDTA) ushlab turishi mumkin, bu bilan polimeraza faolsizlantiriladi va o'z navbatida PCR natijalarining pasayishi yoki noto'g'ri salbiy bo'lishiga olib keladi.
Shu bilan birga, reaktsiya komponentlari va maqsadli nuklein kislotalar o'rtasidagi ko'plab o'zaro ta'sirlar ham "PCR inhibitörleri" sifatida belgilanadi. Izolyatsiya natijasida hujayraning yaxlitligi buzilgan va nuklein kislota chiqarilgandan so'ng, namuna va uning atrofidagi eritma va qattiq faza o'rtasida o'zaro ta'sirlar paydo bo'lishi mumkin. Masalan, “to‘qtiruvchilar” bir yoki ikki zanjirli DNKni kovalent bo‘lmagan o‘zaro ta’sirlar orqali bog‘lashi va PCR reaksiya idishiga yetib boruvchi nishonlar sonini kamaytirish orqali izolyatsiya va tozalashga xalaqit berishi mumkin.
Umuman olganda, PCR ingibitorlari ko'pchilik tana suyuqliklarida va klinik diagnostika testlarida (siydikdagi karbamid, gemoglobin va qondagi geparin), oziq-ovqat qo'shimchalarida (organik komponentlar, glikogen, yog ', Ca2 + ionlari) va atrof-muhitdagi tarkibiy qismlarda (fenollar) ishlatiladigan reagentlarda mavjud. , og'ir metallar)

Ko'proq tarqalgan PCR inhibitörlerini bakteriyalar va eukaryotik hujayralar, maqsadli bo'lmagan DNK, to'qima matritsalarining DNK bilan bog'laydigan makromolekulalari va qo'lqop va plastmassa kabi laboratoriya jihozlarida topish mumkin. Ekstraksiya paytida yoki undan keyin nuklein kislotalarni tozalash PCR inhibitörlerini olib tashlashning afzal usuli hisoblanadi.
Bugungi kunda turli xil avtomatlashtirilgan ekstraksiya uskunalari ko'plab qo'lda ishlaydigan protokollarni almashtirishi mumkin, ammo maqsadlarni 100% tiklash va / yoki tozalash hech qachon amalga oshirilmagan. Potentsial ingibitorlar hali ham tozalangan nuklein kislotalarda mavjud bo'lishi yoki allaqachon kuchga kirgan bo'lishi mumkin. Inhibitorlarning ta'sirini kamaytirish uchun turli strategiyalar mavjud. Tegishli polimeraza tanlash inhibitor faolligiga sezilarli ta'sir ko'rsatishi mumkin. PCR inhibisyonunu kamaytirishning boshqa tasdiqlangan usullari polimeraza kontsentratsiyasini oshirish yoki BSA kabi qo'shimchalarni qo'llashdir.
PCR reaktsiyalarini inhibe qilish ichki jarayon sifatini nazorat qilish (IPC) yordamida ko'rsatilishi mumkin.
Etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol va fenol kabi ekstraksiya to‘plamidagi barcha reagentlar va boshqa eritmalarni nuklein kislota izolatidan yaxshilab yuvish bosqichida olib tashlash uchun ehtiyot bo‘lish kerak. Ularning kontsentratsiyasiga qarab, ular PCRni faollashtirishi yoki inhibe qilishi mumkin.