PCR reaksiyalaridagi aralashuv omillari

PCR reaksiyasi paytida ko'pincha ba'zi aralashuvchi omillarga duch kelish mumkin.
PCR ning juda yuqori sezgirligi tufayli ifloslanish PCR natijalariga ta'sir qiluvchi eng muhim omillardan biri hisoblanadi va noto'g'ri ijobiy natijalarga olib kelishi mumkin.
Soxta salbiy natijalarga olib keladigan turli manbalar ham bir xil darajada muhimdir. Agar PCR aralashmasining bir yoki bir nechta muhim qismlari yoki amplifikatsiya reaksiyasining o'zi inhibe qilinsa yoki aralashsa, diagnostika tahlili to'sqinlik qilishi mumkin. Bu samaradorlikning pasayishiga va hatto soxta salbiy natijalarga olib kelishi mumkin.
Inhibisyondan tashqari, namunani tayyorlashdan oldin jo'natish va/yoki saqlash sharoitlari tufayli maqsadli nuklein kislotasining yaxlitligi yo'qolishi mumkin. Xususan, yuqori harorat yoki yetarli darajada saqlanmaslik hujayralar va nuklein kislotalarning shikastlanishiga olib kelishi mumkin. Hujayra va to'qimalarni fiksatsiya qilish va parafinning joylashishi DNK parchalanishining yaxshi ma'lum sabablari va doimiy muammo hisoblanadi (1 va 2-rasmlarga qarang). Bunday hollarda, hatto optimal izolyatsiya va tozalash ham yordam bermaydi.

1-rasm | Immobilizatsiyaning DNK yaxlitligiga ta'siri
Agaroza gel elektroforezi shuni ko'rsatdiki, otopsiyalarning parafin kesimlaridan ajratib olingan DNKning sifati sezilarli darajada farq qiladi. Fiksatsiya usuliga qarab, ekstraktlarda turli o'rtacha uzunlikdagi DNK mavjud edi. DNK faqat mahalliy muzlatilgan namunalarda va buferlangan neytral formalinda fiksatsiya qilinganida saqlanib qolgan. Kuchli kislotali Bouin fiksatori yoki buferlanmagan, chumoli kislotasi o'z ichiga olgan formalindan foydalanish DNKning sezilarli darajada yo'qolishiga olib keldi. Qolgan fraksiya yuqori darajada parchalangan.
Chap tomonda, fragmentlarning uzunligi kilobaza juftliklarida (kbp) ifodalanadi.

2-rasm | Nuklein kislota nishonlarining yaxlitligini yo'qotish
(a) Ikkala zanjirdagi 3′-5′ bo'shliq maqsadli DNKning uzilishiga olib keladi. DNK sintezi hali ham kichik fragmentda sodir bo'ladi. Biroq, agar DNK fragmentida primer tavlash joyi yo'q bo'lsa, faqat chiziqli amplifikatsiya sodir bo'ladi. Eng qulay holatda, fragmentlar bir-birini qayta to'yintirishi mumkin, ammo hosildorlik kichik va aniqlash darajasidan past bo'ladi.
(b) Asosan depurinatsiya va timidin dimerining hosil bo'lishi tufayli asoslarning yo'qolishi H-bog'lanishlar sonining kamayishiga va Tm ning kamayishiga olib keladi. Uzoq muddatli isitish bosqichida primerlar matritsa DNKsidan erib ketadi va hatto unchalik qattiq bo'lmagan sharoitlarda ham tavlanmaydi.
(c) Qo'shni timin asoslari TT dimerini hosil qiladi.
Molekulyar diagnostikada tez-tez uchraydigan yana bir keng tarqalgan muammo - bu fenol-xloroform ekstraktsiyasiga nisbatan maqsadli nuklein kislotalarning optimal darajadan pastroq ajralib chiqishi. Haddan tashqari holatlarda bu noto'g'ri salbiy natijalar bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Qaynatish lizisi yoki hujayra qoldiqlarini fermentativ hazm qilish orqali ko'p vaqtni tejash mumkin, ammo bu usul ko'pincha nuklein kislotalarning yetarli darajada ajralib chiqmasligi tufayli past PZR sezgirligiga olib keladi.

Amplifikatsiya paytida polimeraza faolligini inhibe qilish

Umuman olganda, inhibisyon suboptimal PCR natijalariga olib keladigan barcha omillarni tavsiflash uchun konteyner tushunchasi sifatida ishlatiladi. Qat'iy biokimyoviy ma'noda, inhibisyon fermentning faolligi bilan cheklangan, ya'ni u DNK polimerazasining faol markazi yoki uning kofaktori (masalan, Taq DNK polimerazasi uchun Mg2+) bilan o'zaro ta'sir orqali substrat mahsulotining konversiyasini kamaytiradi yoki oldini oladi.
Namunadagi komponentlar yoki reaktivlarni o'z ichiga olgan turli buferlar va ekstraktlar fermentni to'g'ridan-to'g'ri inhibe qilishi yoki uning kofaktorlarini (masalan, EDTA) ushlashi, shu bilan polimerazani inaktivatsiya qilishi va o'z navbatida PCR natijalarining pasayishiga yoki noto'g'ri salbiy bo'lishiga olib kelishi mumkin.
Biroq, reaksiya komponentlari va nishonni o'z ichiga olgan nuklein kislotalar o'rtasidagi ko'plab o'zaro ta'sirlar "PCR ingibitorlari" deb ham ataladi. Hujayraning yaxlitligi izolyatsiya orqali buzilgandan va nuklein kislota ajralib chiqqandan so'ng, namuna va uni o'rab turgan eritma va qattiq faza o'rtasida o'zaro ta'sirlar paydo bo'lishi mumkin. Masalan, "axlat yig'uvchilar" kovalent bo'lmagan o'zaro ta'sirlar orqali bitta yoki ikki zanjirli DNKga bog'lanishi va oxir-oqibat PCR reaksiya idishiga yetib boradigan nishonlar sonini kamaytirish orqali izolyatsiya va tozalashga xalaqit berishi mumkin.
Umuman olganda, PZR ingibitorlari klinik diagnostika testlari uchun ishlatiladigan ko'pgina tana suyuqliklari va reagentlarida (siydikdagi karbamid, qondagi gemoglobin va geparin), parhez qo'shimchalarida (organik komponentlar, glikogen, yog', Ca2+ ionlari) va atrof-muhitdagi komponentlarda (fenollar, og'ir metallar) mavjud.

Ko'proq uchraydigan PZR ingibitorlarini bakteriyalar va eukaryotik hujayralarda, nishonga olinmagan DNKda, to'qima matritsalarining DNK bilan bog'lanadigan makromolekulalarida va qo'lqop va plastmassa kabi laboratoriya uskunalarida topish mumkin. PZR ingibitorlarini olib tashlashning afzal usuli ekstraksiya paytida yoki undan keyin nuklein kislotalarni tozalashdir.
Bugungi kunda turli xil avtomatlashtirilgan ekstraksiya uskunalari ko'plab qo'lda bajariladigan protokollarni almashtirishi mumkin, ammo nishonlarni 100% tiklash va/yoki tozalash hech qachon amalga oshirilmagan. Potensial ingibitorlar tozalangan nuklein kislotalarda hali ham mavjud bo'lishi yoki allaqachon kuchga kirgan bo'lishi mumkin. Ingibitorlarning ta'sirini kamaytirish uchun turli xil strategiyalar mavjud. Tegishli polimerazani tanlash ingibitor faolligiga sezilarli ta'sir ko'rsatishi mumkin. PCR inhibisyonini kamaytirishning boshqa tasdiqlangan usullari polimeraza konsentratsiyasini oshirish yoki BSA kabi qo'shimchalarni qo'llashdir.
PCR reaksiyalarining inhibatsiyasini ichki jarayon sifatini nazorat qilish (IPC) yordamida ko'rsatish mumkin.
Ekstraksiya to'plamidagi barcha reagentlar va boshqa eritmalarni, masalan, etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol va fenolni nuklein kislota izolatidan yaxshilab yuvish bosqichida olib tashlashga ehtiyot bo'lish kerak. Ularning konsentratsiyasiga qarab, ular PZRni faollashtirishi yoki inhibe qilishi mumkin.