PCR reaktsiyalarida aralashuv omillari

PCR reaktsiya paytida ba'zi murosasizlik omillar ko'pincha duch keladi.
PCRning yuqori sezgirligi tufayli ifloslanish PCR natijalariga ta'sir ko'rsatadigan eng muhim omillardan biri hisoblanadi va yolg'on ijobiy natijalarga olib keladi.
Soxta salbiy natijalarga olib keladigan turli xil manbalar bir xil darajada tanqidiydir. Agar PCR aralashmasining bir yoki bir nechta zarur qismlari yoki kuchaytiriladigan reaktsiyaning o'zi buzilgan bo'lsa yoki xalaqit bersa, diagnostika Assasi xalaqit berishi mumkin. Bu samaradorlik va hatto soxta salbiy natijalarga olib kelishi mumkin.
Namuna tayyorlashdan oldin etkazib berish va / yoki saqlash sharoitlari tufayli maqsadli nuklon kislotasi yaxlitligi tufayli maqsadli nuklon kislotasi yaxlitligini yo'qotish mumkin. Xususan, yuqori haroratlar yoki etarli darajada saqlash hujayralar va nuklein kislotalarning shikastlanishiga olib kelishi mumkin. Hujayra va to'qima fiksatsiyasi va kerosinni ekish DNK parchalanishining taniqli sabablari va doimiy muammo (1 va 2-rasmlarga qarang). Bunday hollarda, hatto optimal izolyatsiya va tozalash yordam bermaydi.

1-rasm | DNK yaxlitligiga ta'sir qilish samarasi
Azaroz GeleleleleleSis avtopazning parafin bo'limlaridan ajratilgan DNK sifati avtoparylarning sifati sezilarli darajada farq qiladi. DNK turli xil o'rtacha bo'laklarning uzunligi fiksatsiya usuliga qarab ekstraktlarda mavjud edi. DNK faqat mahalliy muzlatilgan namunalarda va neytral formainda saqlanib qolgan. Kislotali booulni mahkamlash yoki buzilmagan, forma kislotasi tarkibiga ega formaning sezilarli yo'qotishiga olib keldi. Qolgan kassa juda taqsimlangan.
Chapda, bo'laklarning uzunligi kilobaz juftligi (KBP) da ifodalanadi

Rasm 2 | Nuklein kislotasi maqsadlarining yaxlitligini yo'qotish
(a) Ikkala ipda 3'-5 deraligi maqsadli DNKda tanaffusga olib keladi. DNK sintezi kichkina parchasida hali ham paydo bo'ladi. Ammo, agar DNK parchasida primer saytida primer saytida etishmovchiligi yo'q bo'lsa, faqat chiziqli kengaytirish paydo bo'ladi. Eng qulay holatda, parchalar bir-birlarini mustahkamlashi mumkin, ammo hosildorlik kam va undan past darajada aniqlanadi.
(b) asosan deputat va thyidinning pasayishi tufayli bazalarning yo'qolishi, H-obligatsiyalar sonining pasayishiga va TM ning pasayishiga olib keladi. Cho'zilgan isitish bosqichida, astarchi matritsa DNKdan uzoqlashadilar va kamroq shartlarga qaramay uni yo'q qilmaydi.
(c) qo'shni timin bazalari ttni xiralashtiradi.
Erekulyar diagnostikada ko'pincha yuzaga keladigan yana bir muammo fenol-xloroform qazib olish bilan taqqoslaganda maqsadli nuklein kislotalarining maqbul chiqishidir. Avaksiyalarda bu soxta salbiy ta'sir ko'rsatishi mumkin. Ko'p vaqt hujayra qoldiqlarini qaynatish yoki fermentli hazm qilish bilan saqlab qolish mumkin, ammo bu usulda nuklein kislotasi yetarli bo'lmaganligi sababli PRCning pastligi past bo'ladi.

Polimeraza faoliyatini kuchaytirish paytida inhibe qilish

Umuman olganda, inhibitsiyaning kontseptsiyasi sifatida kontseptsiyas kontseptsiyasi sifatida ishlatiladi. To'g'ri biokimyoviy ma'noda inhibitsiyasi fermentning faoliyati bilan cheklangan, ya'ni DNK polimerazining faol sayti yoki uning vergosi ​​uchun MGT2 + uchun aylanalarni kamaytiradi yoki oldini oladi.
Namuna yoki turli xil tamponlar va ekstraktlar tarkibidagi komponentlar to'g'ridan-to'g'ri fermentni (masalan, o'z kofaktini (masalan, iloji boricha iloji boricha infektsiyani (masalan, cho'kindi) va "Soxta" PROFF "Natijada olib kelishi mumkin.
Biroq, reaktsiya tarkibiy qismlari va maqsadli nuklein kislotalari o'rtasidagi ko'plab o'zaro ta'sirlar ham "PCR Ahribibitors" sifatida belgilanadi. Hujayraning yaxlitligi izolyatsiya va nuklein kislotasi chiqariladi, namuna va uning atrofidagi ta'sirlar va qattiq fazasi paydo bo'lishi mumkin. Masalan, "soqollovchilar" kovalsiz shovqinlar va tozalash va tozalash bilan aralashishga xalaqit berishi mumkin, natijada PCR reaktsiyasi kemasiga etib borishi bilan izolyatsiya va tozalash.
Umuman olganda, PCR inhibitorlari klinik diagnostika sinovlari uchun ishlatiladigan eng ko'p suyuqlik va reaktivlar, parhez qo'shimchalar (organik tarkibiy qismlar, glikogen, yog ', CAS + ionlari) va atrof-muhitdagi komponentlar (fenollar, og'ir metallar)

Ko'proq tarqalgan PCR inhibitorlari bakteriyalar va enukarik hujayralar, maqsadli DNK, DNKni bog'laydigan makritikalar va qo'lqoplar va plastmassa kabi laboratoriya uskunalari uchun topish mumkin. Ekranda yoki undan keyin nuklein kislotalarini tozalash, PCR inhibitorlarini olib tashlashning afzal ko'rgan usuli.
Bugungi kunda turli xil avtomatlashtirilgan qazib olish uskunalari ko'plab qo'l protokollarini almashtirishi mumkin, ammo maqsadlarni 100% tiklash va / yoki tozalash hech qachon erishilmadi. Potentsial inhibitorlar hali ham tozalangan nuklein kislotalarida mavjud bo'lishi yoki allaqachon kuchga kirishi mumkin. Ingiboriyalarning ta'sirini kamaytirish uchun turli xil strategiyalar mavjud. Tegishli polimerazani tanlash inhibitor faoliyatiga jiddiy ta'sir ko'rsatishi mumkin. PRRning inhibhionini kamaytirish uchun boshqa tasdiqlangan usullar polimaza kontsentratsiyasini kuchaytirmoqda yoki BSA kabi qo'shimchalarni qo'llashni kuchaytiradi.
PCRning inhibelashi Ichki jarayon sifatini boshqarish (IPC) yordamida ko'rsatilishi mumkin.
Etanol, Etan, EDTA, SETAB, LISCL, GESPL, GESPL, GAUSSN, DAKL, Finol, yadro kislotidan tortib, yadro kislotidan tortib, yadroli kislotadan puxta yuvish bosqichida olib tashlanishi kerak. Ularning konsentratsiyaga qarab, ular PCRni faollashtirish yoki inhibe qilishlari mumkin.